استشهد(عليه السلام) سنة 40 من الهجرة في شهر رمضان، وقد ضرب ليلة تسع عشرة ليلة الأربعاء و قبض ليلة الجمعة ليلة إحدى و عشرين و عمره ثلاث و ستون سنة، و كانت مدة خلافته خمس سنين.

قال الطبري في تاريخه و ابن الأثير في الكامل (كان سبب قتله(عليه السلام) ان عبد الرحمن بن ملجم المرادي و البرك بن عبد الله التميمي الصريمي و اسمه الحجاج و عمرو بن أبي بكر التميمي السعدي و هم من الخوارج اجتمعوا فتذاكروا أمر الناس و عابوا الولاة ثم ذكروا أهل النهر فترحموا عليهم و قالوا ما نصنع بالبقاء بعدهم فلو شرينا أنفسنا لله و قتلنا أئمة الضلال و أرحنا منهم البلاد فقال ابن ملجم أنا أكفيكم عليا و قال البرك بن عبد الله أنا أكفيكم معاوية و قال عمرو بن بكر أنا أكفيكم عمرو بن العاص فتعاهدوا ان لا ينكص أحدهم عن صاحبه الذي توجه إليه حتى يقتله أو يموت دونه و اخذوا سيوفهم فسموها و اتعدوا لتسع عشرة أو سبع عشرة من رمضان فأتى ابن ملجم الكوفة فلقي أصحابه بها و كتمهم أمره و رأى يوما أصحابا له من تيم الرباب و معهم امرأة منهم اسمها قطام بنت الأخضر التيمية، وكانات قد قتل أبوها و أخوها يوم النهر و كانت فائقة الجمال فخطبها فقالت لا أتزوجك إلا على ثلاثة آلاف و عبد و قينة و قتل علي فقال أما قتل علي فما أراك ذكرته و أنت تريدينني قالت بل التمس غرته فان أصبته شفيت نفسك و نفسي و نفعك العيش معي و ان قتلت فما عند الله خير من الدنيا و ما فيها قال و الله ما جاء بي إلا قتل علي فلك ما سالت قالت سأطلب لك من يشد ظهرك و يساعدك و بعثت إلى رجل من قومها اسمه وردان فأجابها، و أتى ابن ملجم رجلا من أشجع اسمه شبيب بن بجرة فقال هل لك في شرف الدنيا و الآخرة قال و ما ذاك قال قتل علي بن أبي طالب قال شبيب ثكلتك أمك لقد جئت شيئا ادا كيف تقدر على قتله قال اكمن له في المسجد فإذا خرج إلى صلاة الغداة شددنا عليه فقتلناه قال ويحك لو كان غير علي كان أهون قد عرفت سابقته و فضله و بلاءه في الإسلام و ما أجدني انشرح لقتله قال أما تعلمه قتل أهل النهر العباد الصالحين قال بلى قال فلنقتله بمن قتل من أصحابنا فأجابه فلما كان ليلة الجمعة و هي الليلة التي واعد ابن ملجم فيها أصحابه على قتل علي(عليه السلام) و معاوية و عمرو جاءوا قطام وهي في المسجد الأعظم معتكفة فدعت لهم بالحرير و عصبتهم به صدورهم و تقلدوا سيوفهم و مضوا فجلسوا مما يلي السدة التي كان يخرج منها أمير المؤمنين(عليه السلام) إلى الصلاة و قد كانوا قبل ذلك القوا إلى الاشعث ما في نفوسهم من العزيمة على قتل أمير المؤمنين(عليه السلام) وواطأهم على ذلك و حضر الاشعث في تلك الليلة لمعونتهم و كان حجر بن عدي في تلك الليلة بائتا في المسجد فسمع الاشعث يقول لابن ملجم النجاء النجاء لحاجتك فقد فضحك الصبح فأحس حجر بما أراد الاشعث فقال قتلته يا اعور و خرج مبادرا ليمضي إلى أمير المؤمنين(عليه السلام) ليخبره الخبر و يحذره من القوم فخالفه أمير المؤمنين(عليه السلام) في الطريق فدخل المسجد، قال الطبري و ابن الأثير فلما خرج علي نادى الصلاة الصلاة فضربه شبيب بالسيف فوقع سيفه بعضادة الباب أو الطلق و ضربه ابن ملجم على قرنه بالسيف و قال الحكم لله لا لك يا علي و لا لأصحابك. وقال أبو الفرج فضربه ابن ملجم فاثبت الضربة في وسط رأسه قال ابن عبد البر : فقال علي فزت و رب الكعبة لا يفوتنكم الرجل.

وكان أمير المؤمنين(عليه السلام) لما ضربه ابن ملجم أوصى به فيما رواه الحاكم في المستدرك فقال احسنوا إليه فان اعش فهضم أو قصاص و ان أمت فعاجلوه فإني مخاصمه عند ربي عز و جل و قال الطبري و لما قبض أمير المؤمنين(عليه السلام) بعث الحسن إلى ابن ملجم فأحضره فقال للحسن هل لك في خصلة إني أعطيت الله عهدا ان لا أعاهد عهدا إلا وفيت به و إني عاهدت الله عند الحطيم ان اقتل عليا و معاوية أو أموت دونهما فان شئت خليت بيني و بينه فلك علي عهد الله ان لم اقتله و بقيت ان آتيك حتى أضع يدي في يدك فقال له الحسن لا و الله حتى تعاين النار ثم قدمه فقتله.